Diels-Alder（D-A）反應是一類能夠直接形成C-C鍵的重要有機反應，可以高效地實現(xiàn)對于雜環(huán)、手性螺環(huán)和橋環(huán)等復雜結(jié)構的構筑，被廣泛地應用于合成化學領域；近年來一些特殊的D-A反應還被開發(fā)為“點擊化學”（click chemistry）和“生物正交化學”（bioorthogonal chemistry），并應用于材料科學和生命科學的研究中。通過對于天然產(chǎn)物生源合成途徑的分析，諸多天然產(chǎn)物的骨架構筑過程中可能涉及到D-A反應，因此D-A反應也經(jīng)常被巧妙地應用于天然產(chǎn)物的仿生合成研究中。一方面，隨著分子前線軌道理論的發(fā)展，合成化學家開發(fā)了一系列能夠促進D-A反應的小分子催化劑；另一方面，基于著名化學家鮑林的酶催化理論（生物大分子在催化過程中可以通過主-客體相互作用穩(wěn)定底物小分子的反應過渡態(tài)），人工篩選、制備的能夠識別底物反應過渡態(tài)的抗體酶或核酶也能夠在一定程度上催化分子間的D-A反應。然而，由于缺乏直接的結(jié)構生物學和生物化學證據(jù)，天然產(chǎn)物的生物合成過程中所涉及到的D-A反應是否由酶催化完成以及相應的催化機制目前尚不為人知。近期，中國科學院上海有機化學研究所生命有機化學國家重點實驗室劉文研究員課題組與潘李鋒研究員課題組合作，在國際上首次報道了源于吡咯吲哚霉素（pyrroindomycin，PYR）生物合成途徑中的D-A酶PyrI4及其結(jié)合底物小分子復合物的結(jié)構，并綜合運用生物化學、蛋白質(zhì)核磁共振等研究方法，系統(tǒng)性地闡明了以該蛋白為代表的酶促D-A反應催化機理，相關成果發(fā)表于Cell子刊Cell Chemical Biology雜志上（Cell Chem. Biol., 2016, 23, 352-360.）。
PYR是一類來源于鏈霉菌（Streptomyces rugosporus）的螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酰胺類抗生素，其對于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素的腸球菌（VRE）均有較強的殺傷作用；另外該分子結(jié)構中含有一個[6,6]并環(huán)和一個[6,5]螺環(huán)，這樣兩個可能由酶促D-A反應構筑的結(jié)構單元引起了合成化學家和生物化學家們極大的興趣。在前期的研究中，劉文課題組在國際上首次報道了PYR的生物合成基因簇（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 17342-17345.），又通過體內(nèi)（in vivo）、體外（in vitro）實驗相結(jié)合，首次闡述了PYR分子母核的剛性五環(huán)骨架需要由連續(xù)兩步的酶促D-A反應構筑（Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 259-265.），其中PyrI4催化了用于構筑[6,5]螺環(huán)結(jié)構的D-A反應。
在本研究中，潘李鋒課題組與劉文課題組展開合作，他們首先解析了PyrI4蛋白酶的晶體結(jié)構（apo-型），發(fā)現(xiàn)其具備由β-桶狀結(jié)構構成的剛性骨架；然后通過大量的條件篩選，他們又獲得了PyrI4結(jié)合底物小分子的過渡態(tài)的復合物晶體結(jié)構（holo-型），并基于結(jié)構通過進一步的生物化學研究闡明了該蛋白酶的催化活性空腔與重要氨基酸殘基；隨后，通過比較apo-型與holo-型蛋白結(jié)構的差異并結(jié)合蛋白核磁共振分析，他們發(fā)現(xiàn)PyrI4蛋白N端的前22個氨基酸具有柔性很大的無序結(jié)構，而當?shù)孜锎嬖跁r，該部分序列會參與底物分子的識別，并通過與底物以及β-筒狀結(jié)構之間的特異性相互作用，誘導其自身形成一個特殊的α-螺旋結(jié)構，像“蓋子”一樣把底物分子擠壓到β-筒狀結(jié)構的空腔中，這樣“蓋狀”結(jié)構的形成能夠釋放大量的能量，由此將不利于反應發(fā)生的“熵減效應”轉(zhuǎn)化為利于反應進行的“焓效應”。最后，根據(jù)一系列的生化實驗和理論計算，他們最終提出PyrI4作為催化PYR[6,5]螺環(huán)結(jié)構形成過程中D-A反應的高效催化劑，主要發(fā)揮在如下幾個方面作用：①作為“熵陷阱”（entropy trap），有效地將長鏈底物中二烯體和親二烯體兩部分結(jié)構折疊成能夠有利于發(fā)生D-A反應的構象（即D-A反應的過渡態(tài)構象）；②活性位點處的Q115氨基酸殘基能夠通過與底物親雙烯體部分形成雙氫鍵，降低該部分的LUMO能量，從而促進反應的發(fā)生；③活性空腔中富含酸性氨基酸，酸性的空腔能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，防止pKa較低的酸性底物帶有負電荷；④由底物誘導的N端“蓋狀”結(jié)構能夠通過在蛋白殘基之間形成大量氫鍵和鹽鍵而釋放能量，從而穩(wěn)定蛋白-小分子復合物的結(jié)構，并將原本對反應不利的熵減效應轉(zhuǎn)化為對反應有利的焓效應。
在此前的研究中，國際上僅有兩例[4+2]環(huán)加成酶的晶體結(jié)構被報道，卻都因為缺乏底物-蛋白復合物的結(jié)構而未能闡明其催化機制；另外，這兩例報道也均存在較大的爭議。PyrI4蛋白結(jié)構和功能的闡明，證實了自然界中存在天然的類似于人工抗體酶的催化機制：酶與底物結(jié)合放出能量后，兩者相互的構象誘導使得小分子的構象與D-A反應過渡態(tài)的構象極為相似，由此降低了活化能（Ea）并大大促進了反應的速率，而這一切正源于自然界中蛋白質(zhì)與小分子的共同進化。通過與螺醇縮酮類天然產(chǎn)物生物合成途徑的對比，還可將此類“底物過渡態(tài)構象折疊”酶的反應機制推廣到更多的酶促協(xié)同反應中（Curr.Opin. Chem. Biol., 2016, 31, 95-102.）。本研究為今后人工設計、開發(fā)協(xié)同反應的生物大分子催化劑提供了重要的實驗基礎和方向，并將在未來的合成化學和合成生物學研究中發(fā)揮重要的作用。
劉文課題組的博士生鄭慶飛和潘李鋒課題組的碩士生郭玉嬌為本文的共同第一作者。上述研究工作得到國家青年千人計劃項目、科技部973計劃青年專題項目、國家自然科學基金委面上項目、生命有機化學國家重點實驗室、科技部、上海市科委以及中國科學院的大力資助。
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