糖作為生命體系中三大聚合物分子之一，具有遠(yuǎn)超核酸和蛋白的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。實(shí)現(xiàn)高效的糖結(jié)構(gòu)鑒定和序列解析是開(kāi)展糖類(lèi)物質(zhì)活性與功能研究的基礎(chǔ)，是推動(dòng)糖科學(xué)快速發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。前期工作中，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所高召兵聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)利用基因工程改造后的生物納米孔描繪了糖官能團(tuán)的電信號(hào)指紋圖譜，將納米孔在糖領(lǐng)域的研究從“糖檢測(cè)”正式推進(jìn)至“糖測(cè)序”階段，納米孔糖測(cè)序（nanopore glycan sequencing）已成為研究熱點(diǎn)（J. Am. Chem. Soc.，2023，封面文章）。糖的結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，具備對(duì)復(fù)雜聚糖的綜合傳感能力是實(shí)現(xiàn)納米孔糖測(cè)序需要解決的前提之一，然而已有納米孔均不具備區(qū)分復(fù)雜聚糖的能力。
近期，上海藥物所高召兵/夏冰清（納米孔方向），生命過(guò)程小分子調(diào)控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室文留青（糖化學(xué)方向），程曦（計(jì)算生物學(xué)方向）等組成的聯(lián)合交叉攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，在前期的工作基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種新型的工程化生物納米孔。利用該納米孔，攻關(guān)團(tuán)隊(duì)取得了糖測(cè)序研發(fā)進(jìn)程中的多項(xiàng)進(jìn)展，第一，首次實(shí)現(xiàn)鏈長(zhǎng)達(dá)到十糖的復(fù)雜聚糖電信號(hào)解析，并達(dá)到了單糖分辨率；第二，首次實(shí)現(xiàn)復(fù)雜聚糖分子異構(gòu)體的區(qū)分。特別值得指出的是，更長(zhǎng)聚糖雖然因溶解度不佳未開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，在無(wú)需借助額外適配體和機(jī)器學(xué)習(xí)分析的情況，該技術(shù)已可直接區(qū)分鏈長(zhǎng)達(dá)到十糖的聚糖，顯示了該納米孔設(shè)計(jì)策略的優(yōu)勢(shì)。該工作是生物納米孔糖測(cè)序技術(shù)研發(fā)進(jìn)程中又一節(jié)點(diǎn)性工作，相關(guān)內(nèi)容于2024年4月11日以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”為題在線發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上，并被選為封面文章。
圖1. JACS 封面（高靈敏度工程化納米孔直接區(qū)分復(fù)雜聚糖）
基于前期的工作基礎(chǔ)，為進(jìn)一步優(yōu)化突變納米孔α -溶血素（M113R）的檢測(cè)靈敏度以及檢測(cè)窗口，攻關(guān)團(tuán)隊(duì)對(duì)M113R進(jìn)行新一輪的基因工程改造。在保留一級(jí)傳感位點(diǎn)M113R的基礎(chǔ)上，對(duì)多個(gè)二級(jí)位點(diǎn)進(jìn)行了丙氨酸突變，這有利于在維持信號(hào)響應(yīng)的同時(shí)，增大對(duì)糖分子鏈長(zhǎng)或體積的檢測(cè)限。最終篩選獲得了一種在大尺寸復(fù)雜聚糖傳感中表現(xiàn)出較大潛力的工程化納米孔α -溶血素（M113R/T115A）。利用該突變納米孔，研究人員首先獲得只存在單糖差異的聚糖電信號(hào)，表征了聚糖中的單糖結(jié)構(gòu)差異，說(shuō)明M113R/T115A納米孔對(duì)糖分子結(jié)構(gòu)具備單糖分辨率；其次，研究團(tuán)隊(duì)利用M113R/T115A實(shí)現(xiàn)了從五糖到十糖的連續(xù)檢測(cè)，對(duì)其實(shí)現(xiàn)了顯著區(qū)分，首次將納米孔對(duì)于寡糖的實(shí)際讀長(zhǎng)達(dá)到10（因溶解度限制目前僅測(cè)到10糖），為實(shí)現(xiàn)糖測(cè)序打下基礎(chǔ)；最后，利用該納米孔檢測(cè)了具有不同糖苷鍵的寡糖異構(gòu)體，實(shí)現(xiàn)了不同鏈長(zhǎng)異構(gòu)體的區(qū)分，區(qū)分度達(dá)0.9，說(shuō)明該納米孔可同時(shí)區(qū)分多種寡糖的結(jié)構(gòu)差異。進(jìn)一步通過(guò)剖析納米孔-糖互作模式，闡明了納米孔高靈敏度鑒定復(fù)雜聚糖微小差異的分子機(jī)制。該團(tuán)隊(duì)提供了一種實(shí)現(xiàn)復(fù)雜聚糖鏈長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)區(qū)分的納米孔設(shè)計(jì)范式，其單糖分辨率、鏈長(zhǎng)讀取能力、異構(gòu)差異識(shí)別等為最終攻克納米孔糖測(cè)序發(fā)展過(guò)程中多個(gè)無(wú)法規(guī)避的難點(diǎn)提供重要借鑒。
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圖2. 納米孔M113R/T115A區(qū)分復(fù)雜聚糖?
聚糖的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性包括了種類(lèi)豐富的單糖構(gòu)建模塊、多種形式的糖苷鍵、長(zhǎng)短不一的鏈長(zhǎng)和分支等，這給聚糖分析帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，研究人員在開(kāi)發(fā)基于納米孔的聚糖鑒定方法方面做出了重大努力。這些工作為最終實(shí)現(xiàn)納米孔糖測(cè)序目標(biāo)提供了寶貴的見(jiàn)解。但迄今為止，該領(lǐng)域仍處于初步階段。本研究設(shè)計(jì)的工程化納米孔提供了一種無(wú)適配體、高分辨率的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)聚糖結(jié)構(gòu)的多方位識(shí)別，并在大尺寸、多官能團(tuán)、極微差異的復(fù)雜聚糖識(shí)別上取得突破。
上海藥物所/上海科技大學(xué)/臨港實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合培養(yǎng)博士生姚廣大，上海藥物所田銀平博士、博士生柯文軍、副研究員夏冰清為本文第一作者；上海藥物所/南京中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士生方潔，上海藥物所博士后馬圣洲、研究員李鐵海為本文共同作者；上海藥物所高召兵研究員、生命過(guò)程小分子調(diào)控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室文留青研究員、夏冰清副研究員和程曦研究員為本文共同通訊作者。本研究工作得到了南京大學(xué)龍億濤教授和應(yīng)佚倫教授的支持和幫助。本研究獲國(guó)家杰出青年基金、青促會(huì)創(chuàng)新基金、上海市糖專(zhuān)項(xiàng)、上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃基金、上海市啟明星計(jì)劃、上海市自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃等項(xiàng)目的支持。
全文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02081?
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